研究テーマ１：神経幹細胞の増殖・分化制御

脳を構成する細胞であるニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトは神経幹細胞から産生される。胎児発生期から生後脳・成体脳にいたるまで、神経幹細胞は脳内に存在し、ニューロンやグリア細胞を産生する。神経幹細胞の増殖・維持・細胞分化・休眠には厳密な制御機構が存在している。当研究室では、特に遺伝子発現や細胞内シグナルのダイナミックな変動が、神経幹細胞の制御において担う役割を研究している。下記では、bHLH型転写因子の発現動態の変化が、神経幹細胞の自己複製と多分化能の維持に必須である役割について明らかにした研究について紹介している。この研究を契機に、遺伝子発現の光操作手法を取り入れ、新規技術開発も推進している。

代表的な論文：

Imayoshi, I.*, Isomura, A. (equal contribution), Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T.K., Ishidate, F. and Kageyama, R.* (2013) Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science (Research Article) 342: 1203-1208.

Imayoshi, I.* and Kageyama, R.* (2014) Oscillatory control of bHLH factors in neural progenitors. Trends in Neurosciences 37: 531-538.

Imayoshi, I.* and Kageyama, R.* (2014) bHLH Factors in Self-Renewal, Multipotency, and Fate Choice of Neural Progenitor Cells. Neuron 82: 9-23.

● 研究の背景

神経幹細胞は、自己複製を行うことができ、かつ脳を構成する主要な３種類の細胞であるニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを生み出す多分化能を持つ（図１）。神経幹細胞の自己複製と細胞分化制御機構の解明は、脳神経系の発生機構の解明に繋がるだけでなく、脳損傷や神経変性疾患に対する再生医療の実現に向けた基盤的知識になる。しかし、自己複製能(分化することなく、自分のコピーを作ることができる)と、多分化能(様々な細胞に分化できる)という全く異なる能力をどのようなメカニズムで神経幹細胞は保持しているのかは不明であった。また、神経幹細胞が細胞分化を行う際に、ニューロン、アストロサイト、及びオリゴデンドロサイトという3種類の選択肢の中から、どのように一つの選択肢を選んで分化していく(細胞分化運命決定)のかについてもよくわかっていなかった。

● 研究の内容

神経幹細胞の自己複製と細胞分化はbHLH型転写因子によって制御されている。神経幹細胞の未分化性の維持とアストロサイト分化を制御するHes1、ニューロン分化を制御するAscl1、オリゴデンドロサイト分化を制御するOlig2が重要な働きを担っていることが知られている。しかし、Hes1がどのようなメカニズムで幹細胞の未分化性維持とアストロサイト分化という相反する２つの機能を発揮するのかよくわかっていない。また、Ascl1やOlig2は、ニューロン分化とオリゴデンドロサイト分化以外に、神経幹細胞の増殖・維持にも重要であることが知られているが、この相反する機能をどのように制御しているのかも不明である。本研究では、ホタルの発光たんぱく質であるルシフェラーゼとbHLH型転写因子の融合たんぱく質が発現するような遺伝子改変マウスを作製し、bHLH型転写因子の発現動態を解析した。Hes1、Ascl1、Olig2の3種類のbHLH因子について、ルシフェラーゼとの融合たんぱく質の発現動態を観察・解析した。

顕微鏡システムや画像解析法の至適化により、単一細胞レベルで、細胞分化運命決定因子であるbHLH型転写因子たんぱく質のリアルタイムイメージングに成功した。その結果、神経幹細胞においてHes1、Ascl1たんぱく質は2〜3時間周期で、Olig2たんぱく質は5〜8時間周期でオシレーションしていることが明らかになった（図２）。さらに、Hes1、Ascl1、Olig2のいずれかを欠損した神経幹細胞では細胞増殖が減少していたことから、bHLH型転写因子が発現振動を繰り返すことによって神経幹細胞の細胞分裂を促進することが示唆された。

次に、神経幹細胞に細胞分化を誘導して、Hes1, Ascl1、Olig2たんぱく質の発現動態をリアルタイムイメージングにて解析した。その結果、ニューロン分化の際にはAscl1の発現が、アストロサイト分化の際にはHes1の発現が、オリゴデンドロサイト分化の際にはOlig2の発現がそれぞれ蓄積することが明らかになった（図３）。神経幹細胞からどれかの細胞種に分化運命決定が行われる際には、発現振動(オシレーション)を繰り返していたHes1, Ascl1、Olig2たんぱく質のどれか１種類の発現レベルが上昇して蓄積し、他の2種類のたんぱく質の発現が消失した。

ルシフェラーゼとbHLH因子の融合たんぱく質の発現動態の観察結果から、Hes1、Ascl1、Olig2などの細胞分化決定因子は、神経幹細胞にもすでに発現しており、発現振動を繰り返すことで神経幹細胞の増殖を促進すると考えられた。一方、細胞分化誘導時にはどれか１種類のbHLH因子の発現が上昇・蓄積し、細胞分化を促進することが明らかになった。神経幹細胞は、複数の細胞分化決定因子をオシレーションさせることで、多分化能を備えつつも未分化性を保持して自身のコピーを作る(自己複製する)と考えられた。

上記の結果から、同一因子が発現動態を変えることによって神経幹細胞の増殖を活性化したり、特定の種類の細胞に分化誘導することが示唆された。たとえば、Ascl1は発現振動すると神経幹細胞の増殖を活性化し、蓄積発現するとニューロン分化を誘導すると考えられた。そこで、光応答性の転写因子であるGAVPOのコドンをヒト化したhGAVPOを用いて、光照射依存的にAscl1の発現動態を人工的にコントロールできる実験系を開発した（図４）。3時間ごとに青色光を照射することでAscl1のオシレーションを、30分ごとに青色光を照射することでAscl1の蓄積発現を神経幹細胞に誘導できた。

神経幹細胞に青色光照射を行い、Ascl1の3時間周期の発現振動を誘導したところ、細胞増殖(自己複製)が促進された。一方、Ascl1の蓄積発現を誘導したところ、ニューロン分化が誘導された。すなわち、従来用いられてきた外来性のたんぱく質や化合物を投与することなく、青色光の照射パターンを変えるだけで、神経幹細胞の増殖やニューロン分化を自在にコントロール可能な技術開発に成功した。この技術は、細胞移植医療などの再生医療への応用が期待される。また、光照射による神経幹細胞の増殖・分化コントロール技術は、脳内の神経幹細胞にも適応できる可能性があり、今後の実用化に向けて開発を推進したいと考えている。

本研究は、自己複製能と多分化能の両立という神経幹細胞を幹細胞足らしめている根幹のメカニズムを明らかにした。Hes1たんぱく質は、神経幹細胞だけではなく、万能細胞(ES細胞・iPS細胞)や造血幹細胞・皮膚幹細胞などほとんどの幹細胞で発現が確認されていることから、本研究で見い出された細胞分化決定因子の振動発現による制御機構は、他の種類の幹細胞においても普遍的に使用されているメカニズムであると考えられ、幹細胞研究全体への幅広い波及効果が予想される。

また、Hes1やAscl1などのbHLH因子の発現動態の変化は、成体脳・海馬における神経幹細胞の休眠・活性化制御においても、重要な働きをしていることが明らかになりました。

Sueda, R., *Imayoshi, I. (equal contribution), Harima, Y. and *Kageyama, R. (2019) High Hes1 expression and resultant Ascl1 suppression regulate quiescent versus active neural stem cells in the adult mouse brain. Genes Dev, 33, 511-523. doi: 10.1101/gad.323196.118. 

日本語での研究紹介はこちら。